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產品說明：

膠原蛋白是結締組織和內臟器官細胞外基質的主要構造成分，但在皮膚、肌腱、骨骼中分布最為廣泛。從遺傳和結構上膠原蛋白分為許多類型。膠原蛋白 I (Collagen,Type I)是由2個α1鏈和1個α2鏈組成的異源多聚體，在37°C， 中性pH下自發形成三螺旋骨架，是一種優秀的細胞培養用基質，廣泛用于肝細胞、成纖維細胞、脊神經節、肌肉細胞、施萬細胞、胚肺細胞、上皮細胞和其他大量細胞系。 還能用于研究細胞生長、分化、遷移以及發育過程中的組織形態發生。

我司提供的鼠尾膠原蛋白l是根據Birkedal-Hansen方法，通過醋酸抽提、氯化鈉沉淀、磷酸氫二鈉沉淀等步驟制備。可用于包被細胞培養器皿，培養細胞表面粘附性，特別適合那些在普通培養器皿表面不易貼壁的細胞，比如成纖維細胞、肝細胞等原代細胞。還可用于三維膠的制備，模擬真實的生長環境，使得細胞在三維環境中生長。

本品為溶于6mM HAc的無菌溶液，濃度5mg/ml, 每個批次產品皆通過細胞培養測試(包括三維空間培養)以保證質量的可靠性。

保存：2-8℃保存，不可凍存，有效期一年

運輸：冰袋運輸

使用說明：

一.細胞培養器皿的表面包被

組織培養器皿的表面包被推薦濃度為1-5μg/cm2，起始濃度可首選5μg/cm2.建議根據具體細胞類型來優化。

1.1 6mM HAc稀釋液的制備

本品以溶于6mM HAc (=0.36g/L HAc) 的無菌溶液形式提供，本身不溶于中性pH,建議用6mM HAc溶液做進一步稀釋。

配制方法:取34.5ul冰醋酸 (17.4 M)加入100ml雙蒸水,充分混勻后即得到6mM HAc溶液，0.22um濾膜過濾除菌后待用。

1.2包被步驟

A.根據自身實驗體系以及優化后的包被濃度來計算所需的膠原蛋白量，并加入相應孔內，確保膠原蛋白溶液完全覆蓋表面。

1) 以包被濃度為5μg/cm2,先用6mM HAc稀釋液將膠原蛋白(5mg/ml) 稀釋到合適的中間濃度，如50μg/ml, 然后參考表1不同培養皿內膠原蛋白加量表來加量到各孔內;

2)以包被濃度為2ug/cm2,先用6mM HAc稀釋液將膠原蛋白(5mg/ml)稀釋到合適的中間濃度，如12ug/ml, 然后參考表1不同培養皿內膠原蛋白加量表來加量到各孔內:

表1：不同培養皿內膠原蛋白加量表

B.室溫孵育1h,小心吸掉多余液體，用無菌PBS清洗3~4次后直接使用。或者加完膠原蛋白溶液后，在超凈臺內開蓋過夜晾干。無菌條件下，包被好的器皿在4-25℃至少可保存3個月。

二. 三維膠原的制備
    當鼠尾膠原蛋白I使用濃度> 1mg/ml, pH 7.0左右皆可形成具有一定強度的三維膠，建議成膠濃度為1-2 mg/ml.
    由于本品是以溶于6mM HAc的無菌溶液形式提供，在成膠過程需先加入0.06倍體積的0.1M NaOH中和。

2.1需要溶液準備(無菌、 預冷)
10xPBS (可含酚紅)或10x細胞培養液
0.1M NaOH
雙蒸水

2.2三維膠原制備(不含細胞) (以配制1ml, 1mg/ml三 維膠為例) :
a，取200μl膠原蛋白 (5mg/ml) 加到置于冰浴的離心管內，加入690uI無菌水。之后加到12μl 0.1M NaOH [注意:該步驟不能反，如果反過來把12μl 0.1M NaOH加到膠原溶液中，會由于NaOH不能迅速混勻而產生局部的膠原凝結] , 立即混勻。再加入100μl 10xPBS或10x細胞培養液，混勻后立即加到培養器皿中[注意:混勻后pH為7.0左右，如果PBS或培養液中沒有加酚紅，初次使用時需要用pH試紙測試]

b，將培養器皿在室溫(25°C左右) 放置20min待膠凝固后，轉移到培養箱內。[注意] : 如果配制中使用的是10xPBS,需要在做細胞培養前，先加入適當體積的細胞培養液預平衡。

2.3三維膠原制備(含細胞) (以配制1ml, 1mg/ml三 維膠為例) :

a,準備好細胞懸液,并放置于冰浴中。
b，將200μl膠原蛋白(5mg/ml) 加到12μl 0.1M NaOH [注意:該步驟不能反，如果反過來把12ul 0.1M NaOH加到膠原溶液中，會由于NaOH不能迅速混勻而產生局部的膠原凝結]，立即混勻。再加入23μl 10xPBS或者10x細胞培養液，立即混勻[注意:混勻后pH為7.0左右，如果PBS或培養液中沒有加酚紅，初次使用時需要用pH試紙測試]。再加入760μl的細胞懸浮液,混勻后立即加到培養器皿中。
c，將培養器皿在室溫(25°C左右) 放置20min待膠凝固后，加入適當體積細胞培養液，轉移到培養箱中培養。

注意事項：

1、整個操作請于冰上進行，因室溫鼠尾膠原可迅速成膠，操作過程盡量保持低溫。

2、整個操作請在無瑩環境下無瑩操作，避免污染以影響細胞生長。

3、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作

本產品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應用或其他用途。